探讨仙人掌乙醇提取物和超声波提取物对金黄色葡萄球菌标准株（ATCC 25293)，大肠杆菌标准株（ATCC 25922），白色念珠菌标准株（ATCC 90029）三种微生物的体外抑菌效果及其抑菌机制。方法：乙醇提取法和超声波提取法提取仙人掌原液，并用K-B法分别测仙人掌提取物对实验菌株的抑菌效果，常量稀释法检测MIC，并以抑菌曲线初步探讨其抑菌机制。结果：两种方法提取的仙人掌原液对实验菌株均有抑制作用，抑菌曲线表明，乙醇提取物原液能抑制金黄色葡萄球菌在迟缓期和对数期的生长以及抑制大肠杆菌在迟缓期的生长。结论：大理地区的单刺仙人掌提取物对本实验的革兰阳性菌和革兰阴性菌和真菌均有抑菌作用，两种方法提取的仙人掌提取物的抑菌效果有所不同。本研究可为仙人掌提取物的进一步研究和应用打下理论基础。

仙人掌含有丰富的类黄酮化合物、生物碱、甾类化合物及有机酸等成分，它们是各种植物中常见的对食品中腐败菌及致病菌具有抑制效果的化学成分。仙人掌将成为食品天然防腐剂的重要来源之一。
在我国仙人掌的茎、花果均有食用和药用的传统其性苦、凉具有清热解毒、散瘀健胃滋养、强壮、补脾、镇咳、安神、行气活血、清热凉血、减肥降压等功效。其次，“米邦塔”仙人掌原汁对几种常见的细菌性皮肤病有良好的抑菌作用[7]。进行仙人掌提取物的抑菌的抑制作用及抑菌机理的研究，可为开发利用仙人掌资源奠定一定的基础，本文通过对大理地区的单刺仙人掌提取物的总活性成分进行三种代表菌的抑菌效果研究，为其作为药物临床应用或作为食品提供理论参考。目前，全世界正面临化学抗生素危机，因此，越来越多的人把眼光放到了天然植物活性物质的研究上，从而使仙人掌这种传统抗菌药材得到了人们越来越多的重视。近几年来，国内外对仙人掌的抑菌作用虽然有所研究，但目的主要用于食品防腐，对于一些致病性较强且能引起多种疾病的病菌的抑制作用鲜见报道。
1、材料与方法
1.1实验菌株、试剂和主要仪器
标准菌株：金黄色葡萄球菌标准株（ATCC 25923） 大肠杆菌标准株（ATCC 90029) 由XX学院病原微生物学实验室保存，大理单刺仙人掌由小组成员赴大理市下关凤仪采得，牛肉膏蛋白胨培养基、MH培养基、沙保弱培养基、琼脂粉、无水乙醇、丙三醇、购自大理浩达试剂公司，超净台、双目物影显微镜、电子天平、恒温箱、立式压力蒸汽灭菌器、烘烤箱、离心机、酶标仪、摇床、游标卡尺、加样枪及枪头、0.5麦氏比浊管及比浊板、EP管、离心管、毛细吸管、试管及塞子、试管架、滴管、移液管、烧杯、酒精灯、玻璃漏斗、打孔器、培养皿、锥形瓶、由XX学院微生物实验室提供。
旋转蒸发仪（RE-2000）、真空冷冻干燥器、粉碎机、抽滤瓶、由XX学院药化实验室提供。
1.2仙人掌的采摘
取2kg经XX 学院药学院专家鉴定后的单刺仙人掌，去刺洗净切条后置于烘烤箱中60℃，96h，烘干后粉碎。
1.3乙醇提取法提取仙人掌原液
新鲜仙人掌80%乙醇，充分振荡，浸取40h，取上清液，渣中加入600mL 80%乙醇充分振荡，浸取48h，取上清液后并两次上清液负压抽滤，减压浓缩后进行冷冻干燥，得到固体提取物10.61g。
1.4超声波提取法提取仙人掌原液[16]
仙人掌粉末20g 80%乙醇1:20浸泡6h，超声波（频率70k/Hz放射1s，间歇1s），作用20min过滤，取滤渣添加80%乙醇400mL，超声波放射，合并两次滤液，4℃冰箱过夜沉淀多糖，4500r/min，离心10min，取上清液，真空冷冻干燥，得到提取物3.45g。
1.5药物纸片制备[17]
将直径7mm的圆形滤纸片放入EP管中121℃灭菌30min，分别加入提取的仙人掌超声波和乙醇提取物，制成含仙人掌提取物0.4g/mL的药物滤纸片，置于灭菌平皿中备用。
1.6 K-B法仙人掌原液的体外抑菌试验
制备0.5麦氏比浊标准的菌悬液，约含1×108-2×108CFU/mL，用棉签接种MH培养基，用镊子以无菌操作技术放置制备的含仙人掌提取物的药物纸片。各纸片圆心之间的距离大于25mm，药物纸片圆心距平板边缘大于15mm，每一种样品重复两次，以相应质量浓度的乙醇作为对照，然后将贴好药物纸片的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的培养皿放入37℃恒温箱中培养24h，白色念珠菌的放入28℃的恒温箱中28h，到时间后分别用十字交叉法测量抑菌圈直径[18]。
1.7 最小抑菌浓度（MIC）测定
采用试管稀释法对0.1g/mL的仙人掌提取液进行梯度稀释，各梯度分别为0.1g/mL、0.05g/mL、0.025g/mL、0.0125g/mL、0.00625g/mL、0.003125g/mL、0.0015625g/mL、0.00078125g/mL，制备各实验菌株0.5麦氏浓度菌悬液，接种各稀释度，使最终菌液浓度为5×105CFU/mL。同时设立培养基对照、细菌生长对照和药液对照，37℃培养24小时观察结果，以完全抑制细菌生长的最低提取物浓度为其MIC[19-20]。
1.8 抑菌机制的初步研究
取7只锥形瓶经消毒后各加入MH培养基18mL，1号和2号在分别加入0.25g 80%乙醇提取物后，1号加入0.5麦氏单位的金黄色葡萄球菌2mL，2号加入0.5麦氏单位的大肠杆菌2mL；3号和4号在分别加入0.5g超声波提取物后，3号加入0.5麦氏单位的金黄色葡萄球菌2mL，4号加入0.5麦氏单位的大肠杆菌2mL。5号为和6号分别为不加药物的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌对照组，7号为不加细菌的培养基对照。置于摇床200rmp/min，37℃培养，分别于0h、3h、6h、9h各取样100uL。放入灭菌后的96孔微孔板酶标仪测A600值，以推算活菌数，以活菌数作为纵坐标，以时间为横坐标利用Excel绘制抑菌曲线。
2.结果
2.1 K-B法检测抑菌效果
仙人掌80%的乙醇提取物和超声波提取物对金黄色葡萄球菌标准株（ATCC 25923）大肠杆菌标准株（ATCC 25922) 和白色念珠菌标准株（ATCC 90029）的抑菌效果，结果表明：①乙醇提取法优于超声波提取法；②乙醇提取物对金黄色葡萄球菌的抑制作用强于大肠杆菌；③两种提取物对真菌的抑菌作用均较弱；④两种提取物对革兰阴性菌和革兰阳性菌均有抑菌效果（表1）。
表1 仙人掌80%的乙醇提取物与超声波提取物抑菌效果
菌株 抑菌圈直径（mm）
80%乙醇提取法 超声波提取法 乙醇对照
金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）
10.90
9.033
7.56
大肠杆菌(ATCC 25922)
10.40
8.967
7.973
白色念珠菌(ATCC 90029)
8.5
8.92
9.30

2.2 试管稀释检测MIC
经试管稀释法（图2）检测仙人掌80%的乙醇提取物和超声波提取物对金黄色葡萄球菌标准株（ATCC 25923）大肠杆菌标准株（ATCC 25922) 和白色念珠菌标准株（90029）的MIC，结果表明：①80%乙醇提取物对金黄色葡萄球菌的抑制作用强于大肠杆菌；②两种方法所得的仙人掌提取物均有一定的抑菌效果，以乙醇提取法更好（表2）。

表2 试管稀释法仙人掌80%乙醇提取物与仙人掌超声波提取物的MIC
菌株 MIC
80%乙醇提取物 超声波提取物
金黄色葡萄球菌
(ATCC 25923) 0.025 0.1
大肠杆菌
(ATCC 25922) 0.05 0.1
白色念珠菌
(ATCC 90029) 0.05 0.1

2.3 抑菌曲线的研究结果
绘制仙人掌80%的乙醇提取物和超声波提取物对金黄色葡萄球菌标准株（ATCC 25923） 和大肠杆菌标准株（ATCC 25922) 的抑菌曲线，结果表明：仙人掌乙醇提取物原液能抑制金黄色葡萄球菌在迟缓期和对数期的生长以及抑制大肠杆菌在迟缓期的生长（图4）。

3讨论
本研究选用金黄色葡萄球菌为革兰阳性菌代表，大肠杆菌为革兰阴性菌代表，选用白色念珠菌为真菌的代表，研究结果表明：仙人掌提取物对试验中的革兰阳性菌和革兰阴性菌以及真菌均有抑菌活性，仙人掌的乙醇和超声波提取物对革兰阳性菌和革兰阴性菌均有较强的抑制作用，但对真菌的抑制作用比前两种弱。这一结果，在对革兰氏阳性菌、阴性菌的作用方面是和韩淑琴等人[21]的结果是一致的，但是，与翁佩芳[22]的结果有所不同，对真菌的作用方面，与翁佩芳等人[22]的研究结果一致，与韩淑琴[21]、胡春菊等人[23]的不同。细菌和真菌对仙人掌提取物的敏感性的差异有可能与Kepteyn所说的真菌与细菌在应急机制上有所不同有关[24]。本实验结果表明，两种方法所得的仙人掌提取物均有一定的抑菌效果，以80%乙醇提取物的抑菌效果较好，超声波提取物次之，其原因有待进一步研究。本研究对仙人掌抑菌制品的进一步加工及其在药用和仙人掌保健品开发方面提供了实践依据。但是在抑菌曲线实验中，仙人掌乙醇提取物原液能抑制金黄色葡萄球菌在迟缓期和对数期的生长，但只能抑制大肠杆菌在迟缓期的生长。其原因可能是由于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌在代谢机制上的不同有关。仙人掌乙醇提取物原液能抑制金黄色葡萄球菌在迟缓期和对数期的生长，说明其能抑制金黄色葡萄球菌在迟缓期的大分子前体物质的合成，并能有效抑制其在对数期细菌的二分裂繁殖。仙人掌乙醇提取物原液只能抑制大肠杆菌在迟缓期的生长，说明其能抑制大肠杆菌在迟缓期的大分子物质的合成，但对大肠杆菌在对数期的二分裂无抑制效果。

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