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基本信息

项目名称:
白屈菜红碱逆转人乳腺癌多药耐药机制探究
小类:
生命科学
简介:
本研究应用western blot、RT-PCR和MTT等方法,探讨了白屈菜红碱逆转乳腺癌多药耐药性的可能分子机制。证实白屈菜红碱可下调乳腺癌耐药细胞系MCF-7Taxol中P糖蛋白的表达,而有效抑制其多药耐药性。并提出在人乳腺癌细胞中,MDR1、MRP1、ABCG2基因的上调是PKCα诱发的多药耐药性的下游信号。为白屈菜红碱(CH)作为一种治疗乳腺癌多药耐药的新型药物提供理论基础。
详细介绍:
【背景】 乳腺癌细胞在药物诱导下对结构和功能不相关的药物产生耐药,称多药耐药现象。在乳腺癌细胞中多药耐药与几种转运蛋白相关:P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、多药耐药相关蛋白(ATP-binding cassette,C-subfamily (CFTR/MRP),member 1,ABCC1)和乳腺癌耐药相关蛋白(ATP-binding cassette, G-subfamily,member 2,ABCG2) [1-4],这些蛋白作为药物排出泵,可以降低胞内的细胞毒性药物浓度。蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)的同工酶,特别是PKCα,对肿瘤细胞表型的出现或维持可能起着重要作用[5-6],而白屈菜红碱(chelerythrine, CH)是PKCα高效选择性抑制剂[7]。本研究旨在探讨CH协同临床常用化疗药紫杉醇和阿霉素逆转人乳腺癌多药耐药的机制,为临床改善乳腺癌化疗效果提供新思路。 【实验方法及结果】 RT-PCR检测CH对耐药细胞系MCF-7Taxol中耐药基因ABCG2、ABCC1和MDR1 mRNA转录影响 用0.1 μmol/L PMA、0.1 μmol/L CH分别处理MCF-7Taxol12 h、72 h后,提取总RNA进行RT-PCR检测,发现:在β-actin扩增条带基本相同的情况下,CH可以下调MCF-7Taxol细胞中MDR1的转录水平(P<0.05),而对另外两个多药耐药基因ABCG2、ABCC1影响不明显(P均>0.05);反之,PMA可以增加MCF-7Taxol细胞中MDR1的转录水平(P<0.05),同样对ABCG2、ABCC1的mRNA水平作用也不明显(P均>0.05) Western blot检测P-gp含量和PKCα蛋白及磷酸化水平 0.1 μmol/L PMA、0.1μmol/L CH分别作用于MCF-7Taxol 12 h、72 h后,Western blot研究表明:PMA处理MCF-7Taxol细胞后,PKCα磷酸化水平提高(P<0.05),P-gp表达量明显增加(P<0.05);而CH则可有效抑制PKCα的磷酸化(P<0.05),并降低P-gp含量(P<0.05),并且此效应随时间延长而更为显著。 MTT法测定乳腺癌细胞对PMA、CH的药物敏感性 选对数生长期的乳腺癌MCF-7细胞和MCF-7Taxol细胞,分别接种于96孔板上,每孔细胞数为2×104,培养过夜后加药。PMA和CH均以4 μmol /L为起始浓度对倍稀释(4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625 μmol/L),每组做3个平行孔,加药后继续培养72 h。MTT实验表明:0.0625~4 μmol/L的CH和PMA作用于MCF-7和MCF-7Taxol细胞72 h后,均可产生细胞毒性作用;其作用存在剂量效应,且随剂量的增加,对细胞生长的抑制更明显。CH对MCF-7敏感株的IC50为(0.16±0.02)μmol/L,对MCF-7Taxol耐药株的IC50为(0.21±0.04)μmol/L;PMA对MCF-7敏感株的IC50为(0.23±0.07)μmol/L,对MCF-7Taxol耐药株的IC50为(0.26±0.06)μmol/L。 PMA、CH对乳腺癌细胞多药耐药性的影响测定 分别用0.1 μmol/L PMA、0.1 μmol/L CH(均低于IC20值剂量)预处理MCF-7和MCF-7Taxol细胞60 h后,接种于96孔细胞培养板,37℃继续加药孵育12 h,PBS轻洗3次后分为两组,一组更换含阿霉素的培养液;另一组更换紫杉醇的培养液。阿霉素终浓度梯度依次为2、4、8、16、32、64、128、256 μg/mL,紫杉醇终浓度梯度依次为0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256 μg/mL,每个浓度设3个复孔。对照只加培养液和溶剂。37℃孵育24 h后进行MTT实验,发现:0.1 μmol/L的PKCα特异性抑制剂CH处理MCF-7Taxol细胞72 h后,其对紫杉醇和阿霉素的耐药性分别降低为处理前的0.17和0.27倍(P<0.01);MCF-7Taxol细胞接受0.1 μmol/L的PMA处理72 h后,其对Tax、ADM耐药性为处理前的3.37和2.92倍(P<0.01)。而接受PMA和CH预处理后,MCF-7耐药性变化却不显著(P>0.05)。表明PKCα功能的上调可以提高乳腺癌耐药细胞株的多药耐药性,CH则可抑制上述过程。 【讨论】 本研究通过使用PKCα激动剂和抑制剂改变MCF-7Taxol细胞中PKCα功能,来探究PKCα与乳腺癌细胞多药耐药的关系。结果表明,使用PMA72 h后MCF-7Taxol细胞的MDR1表达水平明显升高,而ABCC1和ABCG2的表达则未显出与PKCα功能有明显相关性。Western blot结果表明多药耐药细胞株MCF-7Taxol中pPKCα含量增加时,P-gp的表达增加。MTT结果表明,使用PKCα激动剂PMA后,MCF-7Taxol细胞对紫杉醇和阿霉素的耐药性分别增加3.37和2.92倍。笔者认为,其耐药性的变化,可能是MCF-7Taxol细胞中PKCα功能的上调增加了MDR1的转录水平,增强了P-gp对化疗药物的转运功能, 从而导致耐药性增加。而使用PKCα抑制剂CH后,MCF-7Taxol细胞对紫杉醇和阿霉素的耐药性分别为加药前的0.17和0.27倍,其机制可能为通过抑制PKCα活性,降低PKCα对MDR1的调控,下调P-gp的表达,从而减低其药物泵功能,逆转乳腺癌细胞的多药耐药。同时,本研究还发现PMA和CH对乳腺癌敏感细胞株MCF-7耐药性影响却不明显,表明PKCα活性改变与乳腺癌敏感细胞可能无关。 【参考文献】 [1] Schneiderman RS, Shmueli E, Kirson ED, et al. TTFields alone and in combination with chemotherapeutic agents effectively reduce the viability of MDR cell sub-lines that over-express ABC transporters[J]. BMC Cancer,2010,10(5):229. [2] Takabe K, Kim RH, Allegood JC, et al. Estradiol induces export of sphingosine 1-phosphate from breast cancer cells via ABCC1 and ABCG2[J]. J Biol Chem,2010,285(14):10477-10486. [3] Oh WK, Cho KB, Hien TT, et al. Amurensin G, a potent natural SIRT1 inhibitor, rescues doxorubicin responsiveness via down-regulation of multidrug resistance 1[J]. Mol Pharmacol,2010,78(5):855-864. [4] 程燕红,齐静,熊冬生,等.钙调素拮抗剂O-(4-乙氧基)-丁基-小檗胺对乳腺癌多药耐药细胞系MCF-7/ADR的耐药逆转作用[J].中国医学科学院学报,2006,28(2):164-168. [5] Gleave ME, Monia BP. Antisense therapy for cancer[J]. Nat Rev Cancer,2005,5(6):468-472. [6] Eĭdus LKh, Emel'ianov MO, Korystova AF, et al. Multidrug resistance increase of tumor cells at the effect of radiation and phorbol ether depends on protein kinase C and reactive oxygen species[J]. Radiats Biol Radioecol,2010,50(1):37-41.

作品专业信息

撰写目的和基本思路

乳腺癌的多药耐药与P-糖蛋白介导的药物外排联系密切,研究表明,PKCα可上调P-糖蛋白表达。采用PKCα抑制剂CH及激动剂PMA,结合乳腺癌常用化疗药紫杉醇和阿霉素。分析随着PKCα活性改变,耐药细胞系MCF-7Taxol的存活率及耐药相关基因ABCG2,ABCC1,MDR1和P糖蛋白表达变化,从而阐明CH改善乳腺癌多药耐药的理论基础及其作为新型药物的潜在疗效。

科学性、先进性及独特之处

1、本实验首次发现白屈菜红碱能作为紫杉醇及阿霉素的化疗辅助药物,有效降低乳腺癌细胞的多药耐药性。 2、首次阐明了白屈菜红碱逆转乳腺癌多药耐药性的分子机制,提出MDR1基因的上调是PKCα诱发的多药耐药性的下游信号。

应用价值和现实意义

1、证实PKCα在诱发乳腺癌多药耐药的重要调控作用。 2、提出PKCα也是治疗乳腺癌多药耐药的新药物靶点。 3、为PKCα抑制剂和siRNA在乳腺癌化疗中的使用提供理论基础。

学术论文摘要

目的:研究PKCα抑制剂白屈菜红碱(CH)逆转人乳腺癌细胞多药耐药的机制。方法:应用RT-PCR和Western blot方法,检测CH和PMA作用于乳腺癌耐药细胞系MCF-7Taxol后,耐药相关基因ABCG2、ABCC1、MDR1和P糖蛋白表达的变化。采用MTT方法,分析给予低剂量CH和PMA后,MCF-7Taxol细胞对紫杉醇以及阿霉素耐药性的变化。结果:RT-PCR和Western blot结果表明:CH可以下调MDR1转录水平(P<0.05),降低P糖蛋白的表达(P<0.05);PMA在提高MDR1转录水平(P<0.05)同时增加P糖蛋白的含量(P<0.05)。MTT分析发现:0.1 μmol/L的CH预处理的MCF-7Taxol对紫杉醇和阿霉素耐药性分别降低为加药前的0.17和0.27倍(P<0.01);而使用0.1 μmol/L的PMA预处理后,MCF-7Taxol对紫杉醇和阿霉素耐药性分别增加了3.37和2.92倍(P<0.01)。结论:白屈菜红碱可以逆转人乳腺癌细胞的多药耐药性,其机制与抑制PKCα活性,下调MDR1基因转录水平,降低其表达产物P-gp的水平有关。

获奖情况

1本实验获江苏省高等学校大学生实践创新训练计划 (20090372)立项资助 2本研究成果成果于2011年2月在《中国医学科学院学报》(medline收录,中文核心期刊)33卷第一期 45-50页发表 3本研究设计荣获首届全国大学生基础医学创新论坛暨实验设计大赛“优秀奖”

鉴定结果

申报者的申报情况属实。该作品是第一临床医学院、第四临床医学院及康达学院的四名同学共同完成的,研究论文数据可靠,结论合理,推荐其参加“挑战杯”科技作品竞赛申报。

参考文献

应用技术: 1RT-PCR 2Western blot 3MTT 4细胞培养技术 参考文献: 印莉萍, 祁小廷.细胞分子生物学技术教程.第2版.北京:科学出版社,2005

同类课题研究水平概述

乳腺癌在女性恶性肿瘤中居首位,多药耐药成为影响乳腺癌患者疗效的首要难题。多药耐药,即肿瘤细胞一旦对一种抗癌药物产生耐药,就可对非同一类型的多种结构、细胞靶点和作用机理迥然不同的抗肿瘤药物产生交叉耐药性。细胞的多药耐药由多种机制调控,目前主要认为,由MDR1编码的P-gp作为三磷酸腺苷依赖性跨膜转运因子,具有药物转运泵功能,将药物泵出细胞,降低细胞内药物浓度,从而产生多药耐药。 PKCα是PKC家族的一种亚型。近年的研究认为,P-gp转运药物受PKCα信号转导通路的调节,如PKC激动剂PMA通过对P-gp磷酸化非依赖方式,可降低细胞内的药物聚集,增强肿瘤的耐药性。然而,Yu等用编码PKCα的cDNA 转染药物敏感细胞,发现MDR1过表达,其耐药性显著增加。该研究表明,PKCα可能参与对MDR1转录因子的磷酸化而调控MDR1的转录水平。 本研究通过使用PKCα激动剂和抑制剂改变MCF-7Taxol细胞中PKCα功能,来探究PKCα与乳腺癌细胞多药耐药的关系。结果表明,使用PMA72 h后MCF-7Taxol细胞的MDR1表达水平明显升高,而ABCC1和ABCG2的表达则未显出与PKCα功能有明显相关性,此结果与文献报道一致。Western blot结果表明多药耐药细胞株MCF-7Taxol中pPKCα含量增加时,P-gp的表达增加。MTT结果表明,使用PKCα激动剂PMA后,MCF-7Taxol细胞对紫杉醇和阿霉素的耐药性分别增加3.37和2.92倍。笔者认为,其耐药性的变化,可能是MCF-7Taxol细胞中PKCα功能的上调增加了MDR1的转录水平,增强了P-gp对化疗药物的转运功能,从而导致耐药性增加。而使用PKCα抑制剂CH后,MCF-7Taxol细胞对紫杉醇和阿霉素的耐药性分别为加药前的0.17和0.27倍,其机制可能为通过抑制PKCα活性,降低PKCα对MDR1的调控,下调P-gp的表达,从而减低其药物泵功能,逆转乳腺癌细胞的多药耐药。本实验首次发现将白屈菜红碱作为紫杉醇及阿霉素的化疗辅助药物可以有效降低乳腺癌细胞的多药耐药性。为PKCα抑制剂和siRNA在乳腺癌化疗中的使用提供了一定的理论基础。
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