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基本信息

项目名称:
超顺磁性纳米尺度离子吸附固定化酶载体的制备
小类:
生命科学
简介:
针对传统固定化酶的使用成本高,载体吸附的酶量低、吸附的酶分子易发生解吸是该固定化酶的共性问题。两步法制备本发明载体,使用红外吸收光谱仪(FTIR)、扫描电子显微镜(SEM)、磁震动(VSM)等测定共聚物载体进行结构分析与表征及酶活力测定和固定化酶的吸附性能研究。
详细介绍:
第一步:在5-10nm超顺磁性Fe3O4的条件下,甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)、甲基丙烯酸-2-羟乙酯(HEMA)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)等单体通过乳液聚合反应,形成纳米尺度、包埋Fe3O4、表面带有环氧基的丙烯酸基聚合物。第二步:聚乙烯亚胺(PEI)的氨基与丙烯酸基聚合物表面的环氧基发生缩合反应,形成新型的固定化酶的载体,以β-D-半乳糖苷酶为固定对象,测定载体的吸附性能。使用红外吸收光谱仪(FTIR)、扫描电子显微镜(SEM)、磁震动(VSM)等测定共聚物载体进行结构分析与表征及酶活力测定和固定化酶的吸附性能研究。

作品图片

  • 超顺磁性纳米尺度离子吸附固定化酶载体的制备
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  • 超顺磁性纳米尺度离子吸附固定化酶载体的制备
  • 超顺磁性纳米尺度离子吸附固定化酶载体的制备
  • 超顺磁性纳米尺度离子吸附固定化酶载体的制备

作品专业信息

设计、发明的目的和基本思路、创新点、技术关键和主要技术指标

一、目的: 针对传统固定化酶的使用成本高,载体吸附的酶量低、吸附的酶分子易发生解吸是该固定化酶的共性问题。 二、基本思路: 第一步:在5-10nm超顺磁性Fe3O4的条件下,甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸-2-羟乙酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯等单体通过乳液聚合反应,形成纳米尺度、包埋Fe3O4、表面带有环氧基的丙烯酸基聚合物。第二步:聚乙烯亚胺的氨基与丙烯酸基聚合物表面的环氧基发生缩合反应,形成新型的固定化酶的载体。 三、创新点: (1)载体的离子吸附基团可与酶分子发生牢固吸附,载体能得以再生,再生的载体可以重复使用10次以上;(2)载体稳定性能好,安全无毒,可再生、多次重复使用,具有成本优势;(3)载体的大小达到纳米尺度,可为酶的吸附提供高比表面积,酶的吸附量和酶活回收率比较高;(4) 磁性纳米载体表面接枝聚阳离子化合物PEI,能牢固吸附带负电荷酶蛋白,固定范围广。 四、关键技术和主要技术指标: (1)聚合物纳米载体具有大的比表面积,载体的粒径小于400nm,传质性能好;(2)载体最大磁饱和值为60.2emu/cm3,具有超顺磁性;(3)载体固定酶的最大吸附酶量为76mg/g,活力回收率为96%;(4)载体吸附的酶分子在pH小于8.0、且含有0.6mol/L的NaCl溶液中该载体吸附的酶的解吸率小于5%;而在pH大于10,且NaCl浓度大于1.0mol/L的介质中,吸附的酶分子可完全解吸;(5)再生的载体重复使用十次。

科学性、先进性

(1)载体的离子吸附基团为聚乙烯亚胺,在pH≦10时带高密度的正电荷,可与许多种类的酶分子(等电点小于9.0)发生多点离子吸附,载体与酶分子之间的结合力强,具有良好的操作稳定性。 (2)在极端的pH(>10.0)和高离子强度(NaCl浓度>1.0mol/L)的介质中,吸附的酶分子可完全解吸,载体得到再生,再生的载体可以重复使用,载体的重复使用大幅度降低了固定化酶的成本。 (3)本发明载体的大小为纳米尺度(粒径约400nm),具有高比表面积,可为酶分子的固定化提供大量的吸附位点,载体吸附的酶量大,达76mg/g, 固定化酶的比活力高为96%。 (4)本发明载体的内部包埋超顺磁性Fe3O4,底物向酶催化中心扩散、产物从酶催化中心向外扩散的阻力均较小,纳米尺度的固定化酶具有很好的流动性(类似于游离酶),有利于底物与产物的传质。故本发明载体制备的固定化酶具有较高的催化效率。 (5)本发明载体具有超顺磁性,能定向控制固定化酶的方向和固定速度,其吸附的固定化酶易于在外加磁场中回收。

获奖情况及鉴定结果

作品所处阶段

实验室阶段

技术转让方式

作品可展示的形式

图片

使用说明,技术特点和优势,适应范围,推广前景的技术性说明,市场分析,经济效益预测

本发明的载体对酶的吸附强度比DEAE-Sepharose(二乙氨基乙基琼脂糖)等传统的离子吸附载体增加2-3倍,解决了传统的离子吸附载体固定的酶分子在使用过程中容易发生解吸、脱落等问题。吸附的酶分子经长期使用、酶活力显著下降后,载体可再生、重复使用。本发明载体还具有高比表面积,单位质量载体吸附的酶量大,具有超顺磁性可在磁场中快速回收,制备工艺简单、成本低、安全无毒、适于工业化生产等优点。该载体可固定化多种不同的酶分子(酶分子的等电点小于9.0),用于催化合成(或酶法转化生产)食品配料、食品添加剂以及生物化工产品等领域有广泛的运用前景,推动运用固定化酶技术进行规模化工业生产生物制品以及在生物医药治疗方面提供诊断依据。

同类课题研究水平概述

大量实验表明,固定化酶离子吸附法操作简单,虞英等采用D3ll弱碱性阴离子交换树脂进行脂肪酶的固定化,显示酯化率可达91.3%,但离子吸附法固定化酶载体与酶之间稳定性差,易在不适pH、高盐浓度、高底物浓度及高温条件下解吸脱落。 近年来通过使用改进的离子吸附法固定化酶。Chen等将脂肪酶固定化到Fe3O4磁性纳米粒子(12.7nm)上,分析显示与自由脂肪酶相比,固定化酶的活性增长到原来的1.4倍,稳定性是原来的31倍。刘薇等则以FeCl3和FeSO4制备了Fe3O4磁性纳米粒(20nm),分别用于固定酵母乙醇脱氢酶(YADH)和脂肪酶,表现出良好的磁分离性。肖正华等制备脲酶-Fe3O4 磁性纳米粒子Fe3O4,固定化脲酶的活性约保留原酶活性的30%。Chenliang Pana将β-半糖苷酶固定在纳米Fe3O4-壳聚糖载体上,结果显示50%的乳糖水解时的最大产率为15.5%(W/V),证明该载体是一个固定β-半糖苷酶比较有效的载体。纳米磁性材料作为结合酶载体,但载体与酶往往通过共价键固定,易发生脱落,结合不牢固。 针对纳米磁性材料易于在其表露偶联一些特异性的配体,选择在磁性纳米材料表面修饰。周桓等通过悬浮聚合,以GMA为功能单体,EGDMA和DVB为交联剂,合成新型固定化酶载体时,发现载体分子链上的环氧基易于胺基发生反应。Gülay Bayramoglu将脂肪酶分别固定在poly(GMA-HEMA-EGDMA)和带间隔臂的poly(GMA-HEMA-EGDMA)上,最大固定酶量分别为16.1和28.3mg/g-1,带间隔臂聚合微球吸附酶活力可达45%。 目前国内外制备的固定化酶载体同时具备磁性,达到纳米尺度,将PEI修饰与超顺磁性的聚合物氧化铁纳米颗粒结合的国内外研究报道很少,这种磁性纳米载体表面经阳离子修饰使载体表面带上正电荷,提供多孔结合位点,再通过电荷作用吸附酶,结合能力强,可减少载体用量减少,提高酶催化效率。磁性纳米材料与聚合物复合后,磁性纳米级载体表面富含的活性基团,可使载体综合性能有极大的提高,这种载体既有聚合物材料本身的优点,又兼备了磁性纳米粒子的特异属性,与酶特异性结合,将酶分子牢固吸附到纳米载体表面,达到理想的固定化效果。
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