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基本信息

项目名称:
芹菜素对乳腺癌T47D细胞系的增殖抑制作用及对裸鼠皮下移植瘤的影响
小类:
生命科学
简介:
目前,化疗仍是乳腺癌的主要治疗手段,但化疗会造成骨髓抑制等副作用而限制了化疗药物的使用,因而近年来联合中医药治疗乳腺癌成为研究热点。芹菜素是一种存在于蔬菜,水果及茶叶等植物中的天然化合物,据报道,芹菜素能够对多种肿瘤细胞产生增殖抑制作用,且动物实验表明,芹菜素在体内具有较小的副作用。我们以乳腺癌T47D细胞株为研究对象,初步研究了芹菜素在体外和体内的增殖抑制作用,并探讨其机制。
详细介绍:
乳腺癌已经成为发达国家及发展中国家最为常见女性恶性肿瘤。本研究发现,芹菜素能够诱导G2/M期阻滞,并诱导细胞凋亡,在体内和体外能够有效的抑制乳腺癌T47D细胞株的增殖,可能与芹菜素抑制PI3K/Akt通路相关。 本研究发现,芹菜素可将乳腺癌T47D细胞系的细胞周期阻滞在G2/M期。细胞周期由G2期进入M期需要CyclinB1/Cdc2复合物的参与。Western Blotting结果显示CyclinA,CyclinB1,Cdc2的明显减少,此外,p-Chk2,p-Cdc2,p-Cdc25c及p21表达明显增高。细胞在进入G2期之前,Cdc2被Wee1及Myt1等磷酸化而处于失活状态,同时也可被Cdc25c去磷酸化而激活。芹菜素能够将校检点激酶Chk2磷酸化而激活,后者使得Cdc25c发生磷酸化,进而与14-3-3结合成复合物而失活,磷酸化的Cdc2由于无法去磷酸化而使细胞周期无法通过G2期进入到M期。同时,CyclinA,CyclinB1表达的减少也与G2/M的阻滞密切相关。此外,p21也是细胞周期重要的调节蛋白,升高的p21能够与CyclinB1竞争性结合Cdc2,而产生周期阻滞作用。 除了周期阻滞的作用外,芹菜素能够有效的诱导T47D细胞株发生凋亡。 研究表明,线粒体膜电位的改变可以导致细胞色素c的释放,进而启动凋亡。而线粒体膜电位的改变与位于线粒体表面的凋亡调节蛋白Bcl-2,Bcl-xl及Bax的相对含量有关。Bax/Bcl-2比率的增高被认为是引起线粒体膜电位改变的始动因素。本研究发现,芹菜素能够使凋亡调节蛋白Bcl-2的表达减少,Bax的表达有所增加,提示芹菜素对T47D的凋亡诱导作用可能是通过影响Bcl-2及Bax的表达来实现的。Western Blotting显示,随着芹菜素浓度的增加,Caspase3及PARP的剪切增加。而在时间梯度的Western Blotting结果中,Caspase3和PARP的剪切较浓度梯度有明显的增强,提示适当延长芹菜素的作用时间比单纯增加其浓度能够更为有效的发挥芹菜素的抗肿瘤活性。 此外,Hochest/Mito-red/YO-PRO-1凋亡荧光染色以及流式细胞仪对凋亡率的检测均验证了芹菜素对凋亡的诱导作用。 我们通过YO-PRO-1/PI双染的方法来检测凋亡率。这是一种新型的凋亡检测方法。YO-PRO-1能够进入凋亡或坏死的细胞,与其DNA交联而使细胞发出绿色荧光。正常细胞则可以通过胞吐作用将YO-PRO-1及时排出细胞外,而不能被染色。PI不能透过正常细胞膜,但在晚期凋亡或坏死的细胞中,细胞膜的完整性遭到破坏,使PI进入细胞。因而,该法与传统的AnnexinV/PI双染法相比,具有类似的结果和分析方法,同样可以区分早期凋亡和晚期凋亡,且所检测的凋亡率与AnnexinV/PI双染法有较好的平行度。该法的优点是能够使检测的成本大大减少,有利于多次重复试验和统计学分析。 PI3K/Akt通路是乳腺癌细胞重要的通路,具有重要的生理功能,包括细胞生存,细胞周期调节,细胞的增殖及迁移等等。我们发现,芹菜素能够抑制Akt的磷酸化,因此考虑芹菜素对T47D的增殖抑制作用可能与PI3K/Akt通路的抑制有关。据报道,Akt是细胞周期由G2期进入M期的启动因素。Akt能够抑制G2校检点的功能,从而使细胞周期通过该校检点。具体机制仍不清楚,有文献报道,Akt能够抑制Wee1的激酶活性,使得Cdc2含量增高,此外,还可能与Akt抑制Chk2的激活以及上调CyclinB1,Cdc2的表达相关。 总之,芹菜素能够通过阻滞细胞周期,诱导凋亡等机制有效的抑制乳腺癌T47D细胞株的增殖,该过程可能与芹菜素抑制PI3K/Akt通路有关。且裸鼠皮下移植瘤模型进一步验证了芹菜素在体内的抗肿瘤效果。且有报道,芹菜素能够抑制肿瘤细胞的侵袭和转移,且与多种化疗药联合使用具有协同作用,从而降低化疗药的使用剂量,减少副作用。因而,芹菜素为乳腺癌的治疗提供了一个新的策略,特别是芹菜素与化疗药物联合治疗乳腺癌来减少化疗副作用等方面具有潜在的应用价值,此有待进一步的研究 。

作品专业信息

撰写目的和基本思路

本文以乳腺癌T47D细胞系为研究对象,初步研究了芹菜素在体外和体内条件下对T47D的增殖抑制作用。我们通过MTT实验证实,芹菜素能够有效的抑制乳腺癌T47D细胞系的增殖,且具有浓度依赖性和时间依赖性。而后进一步证实芹菜素对该细胞系的增殖抑制作用是通过诱导细胞凋亡及G2/M期阻滞来实现的,且与PI3K/Akt通路的抑制有关。最后,裸鼠皮下移植瘤模型的建立研究了芹菜素在体内的抗肿瘤效应。

科学性、先进性及独特之处

目前,乳腺癌的化疗虽然明显改善了乳腺癌患者的预后,但是化疗的副作用却限制了化疗药物的使用。芹菜素有别于其他的化疗药物,其能够有效的抑制肿瘤细胞增殖,且副作用较小。有研究发现,芹菜素和5-氟尿嘧啶联用能够减少5-氟尿嘧啶的使用剂量,从而明显减少了化疗的副作用。因此,本研究对乳腺癌的治疗提供了一个新的思路。

应用价值和现实意义

芹菜素是一种天然化合物,具有副作用小、致突变作用低等特点。研究表明,芹菜素具有诱导细胞凋亡,阻滞细胞周期,抑制肿瘤的侵袭和转移及化疗增敏等多种抗肿瘤作用。而且芹菜素广泛存在于多种水果和蔬菜中,因此,芹菜素在肿瘤治疗,特别是在肿瘤的预防等方面具有非常好的应用价值。

学术论文摘要

[摘要] 目的:探讨芹菜素对乳腺癌T47D细胞株的增殖抑制作用及对裸鼠皮下移植瘤的影响。方法:常规培养T47D细胞,通过MTT试验,克隆形成试验评价芹菜素对T47D细胞增殖的影响;Hochest/Mito-Red/YO-PRO-1凋亡荧光染色观察细胞凋亡形态的变化;流式细胞仪检测芹菜素对T47D细胞周期的影响,以及凋亡率;Western Blotting用于检测周期、凋亡的相关指标,以及对PI3K/Akt通路的影响;裸鼠皮下移植瘤模型建立研究芹菜素在体内的抗肿瘤效果。结果:MTT试验及克隆形成试验显示芹菜素能够抑制T47D细胞的增殖(p<0.05);其能够将T47D的细胞周期阻滞在G2/M期(p<0.05);芹菜素能够有效的诱导该细胞系凋亡,与对照组相比,差异有统计学意义(p<0.05);Western Blotting检测芹菜素处理后p-Akt的含量明显减少;动物实验显示实验组移植瘤的增长明显小于对照组(p<0.05)。结论:芹菜素能够使乳腺癌T47D细胞株的细胞周期阻滞在G2/M期,并诱导其凋亡,在体内体外均具有明显的增殖抑制作用,其机制可能与PI3K/Akt通路的抑制相关。

获奖情况

鉴定结果

本研究中所有数据均真实有效

参考文献

[1]. Apigenin and cancer chemoprevention: progress, potential and promise (review). [2].Apigenin Induces Apoptosis through a Mitochondria/Caspase-Pathway in Human Breast Cancer MDA-MB-453 Cells. [3]. Apigenin causes G(2)/M arrest associated with the modulation of p21(Cip1) and Cdc2 and activates p53-dependent apoptosis pathway in human breast cancer SK-BR-3 cells. [4].Apigenin inhibited migration and invasion of human ovarian cancer A2780 cells through focal adhesion kinase. [5]. 5-Fluorouracil combined with apigenin enhances anticancer activity through induction of apoptosis in human breast cancer MDA-MB-453 cells. [6]. Involvement of nuclear factor-kappa B, Bax and Bcl-2 in induction of cell cycle arrest and apoptosis by apigenin in human prostate carcinoma cells. [7]. 用YO-PRO-1和PI联合染色定量检测细胞凋亡. [8]. Exploiting the PI3K/AKT pathway for cancer drug discovery.

同类课题研究水平概述

研究发现,芹菜素能够将乳腺癌细胞的细胞周期阻滞在G2-M期。Cdc2-Cyclin B复合物在细胞周期由G2期进入M期的过程中起着至关重要的作用。Cdc2-Cyclin B的激活与Cdc25c,Cdc25A磷酸酶介导的Cdc2在Tyr-15位点的磷酸化有关。Choi等研究发现,芹菜素能够使乳腺癌SK-BR-3细胞中CDK1,Cyclin A及Cyclin B的表达下降,而CDK抑制因子P21cip1的表达却明显增加。流式细胞仪显示芹菜素能够将SK-BR-3细胞的细胞周期阻滞在G2-M期。此外,P53是阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡的重要因子,研究发现,SK-BR-3细胞经芹菜素处理后P53的表达明显增加。P53蛋白能够通过诱导P21cip1的表达而有效地阻滞细胞周期,控制细胞的增殖。 此外,芹菜素能够通过线粒体途径诱导乳腺癌MDA-MB-453细胞发生凋亡。ErbB2(Her2/neu)基因编码一种185kb的跨膜糖蛋白,属于表皮生长因子家族,约25-30%的乳腺癌患者中能够检测到ErbB2的过表达。该基因的大量表达可以通过影响一系列信号转导通路而促进细胞的增殖并且降低了乳腺癌细胞对5-氟脲嘧啶化疗的敏感性。Choi等研究显示,5-氟脲嘧啶与芹菜素联合使用与单用5-氟脲嘧啶相比,能够更为明显地抑制ErbB2的表达,因此二者的联合具有协同作用。
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