基本信息
- 项目名称：
- 用PCR技术快速检测麦类作物病原微生物的设计与制作
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 科技发明制作A类
- 简介：
- 小麦是我国主要粮食作物，搞好小麦病害的长期治理工作，实现可持续控制，直接关系到小麦增产、农民增收，关系到国家粮食安全。PCR检测具有高效、灵敏、特异性强等优点，可快速监测病原物毒性结构的动态变化。
- 详细介绍：
- 小麦是我国主要粮食作物，种植面积和产量均占夏季粮食作物的80%以上。小麦生产是全年粮食生产的头季，也是夏粮主产区农民收入的重要来源，其产量直接影响粮食市场价格和农民种粮收入。同时，小麦是我国北方地区人民生活的主要口粮，也是我国短缺的粮食品种，目前国内生产仍满足不了消费需求，每年需要从国外进口，弥补国内生产不足。发展小麦生产、提高小麦自给水平是确保我国粮食安全的迫切需要。然而小麦病害是影响我国小麦产量和品质的重要因素之一，因此采取科学有效的综合措施，搞好小麦病害的长期治理工作，实现可持续控制，直接关系到小麦增产、农民增收，关系到国家粮食安全。 目前，在GeneBank中已经报道了多种小麦病害的病原基因序列，应用DNA Star等软件比较与之亲缘关系相近的序列，找出该病原特异的序列设计引物进PCR检测，测序分析，从而发展小麦白粉病、赤霉病、锈病、纹枯病、黄矮病、黄花叶病、全蚀病的特异PCR检测平台。对于未知病原基因序列病害的PCR引物设计，可采用细菌或真菌同亚门非常保守的区域设计通用引物，对于一些知道同属其他小种基因序列的小麦病害，在5.8s等保守区域设计同属的通用引物，PCR扩增、测序后找出病原菌特异的片段，设计特异引物。此外转录内间隔区(1TS)、转录外间隔区(MTS)、基因内间隔区(1GS)存在的序列差别也可以用来设计引物，从而建立未知基因序列的小麦病害的诊断体系。在发展特异PCR的基础上，先后采用通用引物与特异引物进行扩增，以第1轮的PCR产物稀释后作为第2轮PCR的DNA模板，既增加了反应的特异性，也提高了靶序列的丰度，可以弥补PCR可能的假阳性，还可应用于一些具争议的鉴定结果。为了提高检测效率、节约成本，通过最适反应程序的筛选，混合多对特异引物构建多重引物PCR，即在一个反应体系内进行多重PCR，可以同时快速鉴定多种小麦病害 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是一项针对特定的靶DNA序列的体外扩增技术。即通过高温使双链DNA变性形成单链DNA；然后引物与单链DNA互补序列，在低温下结合形成双链；接着在适温下DNA聚合酶将脱氧核苷酸加到引物末端，使之延长，反复循环这三个步骤，每一循环中所合成的新链，都可以作为下一循环中的模板，特定DNA序列的产生随着循环次数的上升呈指数增加：PCR技术目前在植物病害诊断中被广泛应用。如果病原是RNA病毒，则采用反转录PCR(RT—PCR)，先将RNA进行反转录，得到eDNA后再进行PCR扩增；对某一生物体的特异DNA，选择合适的引物对其进行PCR，从而达到检测它的目的。孔维文等和田亚南等利用PCR技术研究柑桔黄龙病时同样发现，利用PCR技术能在未显症状前检测出病原，而且快速准确方便。对于一些尚未获知特异DNA序列的病原，可采用随机引物扩增技术(RAPD)先获一段特异DNA序列，再行设计特异引物进行PCR检测，如Parry等利用RAPD技术从梨孢镰刀菌( poae)中克隆了2个片段，由此设计了两对引物(Vp8 F／R 和Fp82 F／R)，成功地检测了梨孢镰刀菌。通过比较分析PCR扩增条带可得到病原物不同毒性类型的特异性分子标记。定量PCR技术还能对比研究抗感病品种对病菌侵染的反应，如HU等研究表明，在寄主植物被病菌接种后(孢子浸渍)可通过定量PCR立即在感病植物茎端检测到病菌，而抗病植物接种24h后仍未能检测到病菌。本作品的技术关键分别是PCR技术和设计小麦病菌特异引物。能够实现对麦类作物病原菌的检测准确率达到95%以上。 小麦病害PCR检测的关键技术问题主要有DNA的纯度、引物的筛选和PCR的假阳性。 (1)DNA的纯度。标准方法提取的DNA的浓度和效果都很好，但是耗时、设备条件要求高。据资料介绍的改良方法既能达到要求的浓度和效果。同是也减少药品使用，简化实验步骤。 (2)引物的筛选。由于扩增出的序列是由某一小种测序而成，不同地区病原存在变异，单一引物对扩增可能产生假阴性，因此必须多设计几对引物，然后进行筛选优化。 (3)PCR的假阳性。由于PCR的高灵敏度，可能导致一些假阳性现象，除了应用巢式PCR，还可通过几种方法综合诊断分析，以求准确无误。 PCR检测具有高效、灵敏、特异性强等优点，比传统方法更有优势。如病原不需要培养，具有检测单个靶分子的潜力，有极高的灵敏度，在混合培养物中不需要放射性标记等，而且该项技术快速、简便，不需很专业的技术操作，一个人1～2天即可检测上百个样品。PCR技术应用于小麦病害检测，不仅能代替传统烦琐的检测方法，而且有利于小麦新病害的发现与鉴定。除此之外，PCR技术可以鉴定小麦病害病原菌的生理小种、分析遗传变异与DNA指纹图谱等，从而建立全面、系统的小麦病害PCR检测体系。同时通过快速监测病原物毒性结构的动态变化，可以直接为化学防治提供依据。
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作品专业信息
设计、发明的目的和基本思路、创新点、技术关键和主要技术指标
- 目前，在GeneBank中已经报道了多种小麦病害病原菌基因序列，应用DNA Star等软件比较与之亲缘关系相近的序列，找出该病原特异的序列设计引物进PCR检测，测序分析，从而发展小麦白粉病、赤霉病、锈病、纹枯病、黄矮病、黄花叶病、全蚀病的特异PCR检测平台。建立未知基因序列的小麦病害的诊断体系，为预防小麦病虫害提供有效、准确的依据。
科学性、先进性
- 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是一项针对特定的靶DNA序列的体外扩增技术。即通过高温使双链DNA变性形成单链DNA；然后引物与单链DNA互补序列，在低温下结合形成双链；接着在适温下DNA聚合酶将脱氧核苷酸加到引物末端，使之延长，反复循环这三个步骤，每一循环中所合成的新链，都可以作为下一循环中的模板，特定DNA序列的产生随着循环次数的上升呈指数增加：PCR技术目前在植物病害诊断中被广泛应用。PCR检测具有高效、灵敏、特异性强等优点，比传统方法更有优势。如病原不需要培养，具有检测单个靶分子的潜力，有极高的灵敏度，在混合培养物中不需要放射性标记等，而且该项技术快速、简便，不需很专业的技术操作，一个人1～2天即可检测上百个样品。PCR技术应用于小麦病害检测，不仅能代替传统烦琐的检测方法，而且有利于小麦新病害的发现与鉴定。
获奖情况及鉴定结果
- 无
作品所处阶段
- 本作品正处于实验室阶段
技术转让方式
- 无
作品可展示的形式
- 实验室操作，实际检验
使用说明,技术特点和优势,适应范围,推广前景的技术性说明,市场分析,经济效益预测
- 可以鉴定小麦病害病原菌的生理小种、分析遗传变异与DNA指纹图谱等，从而建立全面、系统的小麦病害PCR检测体系。同时通过快速监测病原物毒性结构的动态变化，可以直接为化学防治提供依据。
同类课题研究水平概述
- 当前，此技术已经在食品检测以及医疗诊断方面得到广泛运用，在小麦病害检测方面也已经有所进展，但是运用范围还没有扩展开来，还有很大的研究价值。
